[생물공학실험] The basics of Animal cell culture and calculation doubling time

Animal cell culture

Most biomedical drugs are antibodies or proteins from animal cells. If biomedical proteins are injected into the human body, they are easily broken down and removed by the human defense system. Therefore, not only the structure of the protein but also the glycosylation, which is made up of carbohydrates, is very important. To apply this glycosylation as close as possible to the human body, we mainly use animal cells. This is why antibodies are produced with animal cells that have lower yields, lower production rates, and higher costs than microorganisms (E. coli). Therefore, understanding animal cell culture is very important to produce biomedical properties.
Animal cells are so sensitive that they have to maintain a 5% CO2 environment similar to the human body. In particular, 5% CO2 by bicarbonate (HCO3-) can act as a buffer for pH changes. In addition, most animal cells are attachment cells. So animal cells need to be attached to a particular matrix. In this session, we’re going to experiment with basically removing animal cells and counting the number of cells.

 

 

대부분의 생물의학으로 사용되는 약물은 동물 세포에서 나오는 항체나 단백질입니다. 만약 생물의학인 단백질을 인체에 주입한다면, 사람의 방어 체계에 의해 쉽게 분해되고 제거됩니다. 따라서 단백질의 구조뿐만 아니라 당이 얽혀져서 구성되는 글리코실화 또한 매우 중요합니다. 이 글리코실화를 사람 인체와 최대한 비슷하게 생산하기 위해서, 동물 세포를 주로 사용합니다. 이 때문에 미생물보다 수율, 생산률이 낮고 비용이 매우 높은 동물 세포로 항체를 생산하는 이유입니다. 따라서 동물 세포의 배양을 잘 이해하는 것은 생물의학을 제대로 생산하기 위해 매우 중요합니다.
동물 세포는 매우 민감하기 때문에 인체와 비슷한 환경인 5%의 이산화탄소를 유지해야 합니다. 특히, 중탄산염(HCO3-)에 의해 5% 이산화탄소가 pH 변화의 완충제 역할을 제대로 할 수 있기 때문입니다. 게다가, 대부분의 동물 세포는 부착 세포입니다. 그래서 동물 세포들은 특정 매트릭스에 부착되어야 합니다. 이와 같이 이번 시간에는 기초적으로 동물 세포를 떼고, 세포 숫자를 세는 과정을 실험할 것입니다.

 

 

 

Experiment reagents and equipment

3T3-L1 (embryo fibroblast cell line)

DMEM, FBS, dPBS, Penisilin/Streptomycin, Trypsin-EDTA

6-well plate, Hemocytometer, microscope, centrifuge, 15ml falcon tube, manual counter, incubator.

 

 

Methods

1. Wash twice 3T3-L1 cells attaching to T25 flask with dPBS 1ml
2. Detach the cells from the T-25 flask with Trypsin-EDTA 1ml for 5 minutes
3. Collect the cells with 3 ml media and centrifuge in a 15ml falcon tube (1000rpm, 5min)
4. Remove all media except the cell pellet.
5. Pour new media, 0.5ml, into the falcon tube and resuspend the cell pellet with a pipette.
6. Dry the cell with 5 ul trypan blue and put 10 ul liquid in a hemocytometer. 
7. Wait 3 minutes and measure living cells and dead cells.
8. Measure the cells and following the result, seed the cell solution to a 6-well plate to be suitable cell numbers (6*103 cells number).
9. Incubator during a suitable time. (19 hours)
10. Measure the number of cells in the same ways.

 

4. Results

With the hemocytometer, cell counting results were 25 in the 10-4 ml, but the total liquid is 10ul cell solution + 5 ul trypan blue. So 25*104 *3/2 = 3.75 * 105 (cells/ml) is this solution’s concentration. So, the seeding solution volume is 6*103 / (3.75*105) Cells/ (cells/ml) = 1.6*10-2 ml.

Live cells were 82 cells and dead cells were 19 cells. So cell viability is 82/101 * 100 = 81.08 %. 

After 16 hours in the incubator, when I performed the cell counting process, the cell number was 8.5 cell * 1.5 * 105 = 1.28 * 105 cell/ml. Cells were 8.5 in the hemocytometer. (Average of 4 phases) and the total solution volume is 0.3 ml. So the total cell number is 3.84 * 104. So, the first time Cell is 6E3, and during 19 hours, Cell doubling numbers are 6*103 * 2n = 3.84 * 10^4, n=log2 6.4 = 2.67. There are 2.67 times during 19 hours, as a result, 19/2.67 = 7.11 (hour) is doubling time. 

 

5. Experiment consideration

The doubling time of animal cells has a very long characteristic. It is known that approximately 20 hours and the 7.11 hours obtained in this experiment may not be suitable. In other words, I think the reason for this difference is that the cells were not seeding to the correct cell number because pipetting was not performed properly.

 

동물 세포의 Doubling time은 매우 긴 특징을 갖고 있습니다. 대략적으로 20시간 정도로 알려져 있으며, 이번 실험에서 얻은 7.11 hour는 적합하지 않을 수 있습니다. 즉, 이번 실험에서 이렇게 차이가 나는 이유는 Pipetting을 적절하게 하지 않아 세포가 정확한 Cell number로 Seeding 되지 않았기 때문이라고 생각합니다.

 

 

(사실 이렇게 세포 개수를 정확하게 평가하는 것은 적절하지 않습니다. 완전하게 세포가 떨어지지 않았을 수도 있고, 원심분리 과정에서 세포가 유실됐을 수도 있기 때문입니다. 근데 뭐, 학부 수준에서 실험이라면 그냥 세포 다뤄봤다는 것에 의의를 두면 충분히 괜찮은 실험입니다.)

 

(학사때 써논 건데 혹시나 필요하신 분들을 위한 정보입니다. 학사때 쓴거라 좀 허접함 주의)