Gram Staining (Gram-negative and -positive)
Gram-staining is useful to distinguish certain Microbes, which mostly consist of gram-positive and gram-negative. For the classification of microorganisms, gram-staining is used with each character, in which Gram-positive microbes have a big cell wall with peptidoglycan, and gram-negative have a thin cell wall with peptidoglycan. The Gram-negative/-positive classification is the most representative example of classifying microorganisms. For example, E.coli, which we will use in this experiment, is a representative gram-negative microorganism, and L. reuteri (Lactobacillus) is a representative gram-positive microorganism. The gram staining is one of the most overall experiments to perform the microbe’s classification.
미생물은 대부분 그램 양성 및 그램 음성으로 구성되어 있습니다. 미생물의 분류는 그람 염색법이 각 문자와 함께 사용되는데, 그람 양성 미생물은 펩티도글리칸이 있는 세포벽이 크고 그람 음성균은 펩티도글리칸이 있는 세포벽이 얇습니다. 그람 음성/양성 분류는 미생물을 분류하는 가장 대표적인 예입니다. 예를 들어 이번 실험에 사용할 대장균은 대표적인 그람음성 미생물이고, L. reuteri(락토바실러스)는 대표적인 그람양성 미생물입니다. 그람 염색은 미생물 분류를 위한 가장 전반적인 실험 중 하나 입니다.
Materials
E. coli, L. reuteri
Alcohol lamp, slide, crystal violet, water, iodine, 95% ethanol, safranin, microscope
Methods
- Take a small inoculum and smear that on the prepared slide with a nichrome wire loop under a sterile environment
- Fix the cells to the slide by heat fixation by passing it (cell side up) through a flame. Do not let the glass become hot to the touch.
- Add crystal violet (0.1 ml) on the slide by covering the heat-fixed cells. Allow staining for 1 min 30 sec.
- Wash the slide with distilled water.
- Add iodine solution (0.1 ml) as a mordant, fix the dye, and leave it for 1 minute.
- Wash the slide with distilled water.
- Decolorize the sample by applying 95% ethanol (50 ml) for 15 seconds and wash it briefly out with distilled water.
- Flood slide with safranin (100 ml) counterstain for 1 min 30 sec and wash with water.
- Blot excess water using absorption paper and allow the slide to dry.
- Use the microscope and observe these slides.
4. Results
After dyeing the gram, it was taken using a microscope. The picture on the left is distinctly red, while the picture on the right is faint purple. I think the reason why it is not clear purple is because the ethanol processing time was too long in “Material 7” and the iodine melted out. Ethanol can remove iodine quickly, so it should only be processed for a short time. The red microorganism in the picture on the left is Gram-negative bacteria, and the purple microorganism on the right is Gram-negative bacteria. As I said in the introduction, E. coli is typically Gram-negative and L. reuteri is typically Gram-positive.
그램 염색 후에는 현미경을 사용하여 찍은 사진 입니다. 왼쪽 사진은 뚜렷한 빨간색임에 반해, 오른쪽 사진은 희미한 보라색입니다. 뚜렷한 보라색을 띄지 못한 이유는 Material 과정 7에서 에탄올 처리 시간이 너무 길어 iodine이 녹아 나왔기 때문이라고 생각합니다. 에탄올은 iodine을 빠르게 제거할 수 있기 때문에 짧은 시간만 처리해야합니다. 왼쪽 사진의 빨간색 미생물은 그람 음성 박테리아이고, 오른쪽의 보라색의 미생물은 그람 음성 박테리아입니다. 앞서서 말했 듯이, 대장균은 전형적으로 그람 음성 박테리아이고 L. reuteri는 전형적으로 그람 양성 박테리아입니다.
5. Discussion
First, the sample was fixed to the slide with fire and processed the crystal violet. The Crystal Violet consists of Crystal Violation (CV+) + Cl–. Because the cell walls of microorganisms are negative, CV+ can be easily attached. CVI is purple when Iodide is handled by Slide, CV++ I–> CVI. At this point, Gram-positive and negative bacteria are dyed purple in phase. Because high concentrations of ethanol can dissolve CVI, thin-walled Gram-negative microorganisms are quickly bleached with high concentrations of ethanol within five seconds. On the other hand, in Gram-positive bacteria, CVI is more strongly attached to the cell wall, so the fast ethanol treatment does not lose its purple color. The next time you treat safranin, this material can dye the cell wall without CVI red. Therefore, the safranin cannot operate in Gram-positive cells with CVI. So Gram-positive bacteria are purple, while Gram-negative bacteria are red. This principle distinguishes Gram-negative bacteria from Gram-positive bacteria.
먼저 샘플을 슬라이드에 불로 고정하고, 크리스탈 바이올렛을 처리합니다. Crystal Violet은Crystal Violation (CV+) + Cl–로 구성됩니다. 미생물의 세포벽은 음성이기 때문에 CV+가 쉽게 부착될 수 있습니다. Iodide를 Slide, CV+ + I– -> CVI에서 처리할 때 CVI는 보라색입니다. 이 때는 그람 양성 및 음성 박테리아가 단계에서 보라색으로 염색됩니다. 고농도 에탄올은 CVI를 녹일 수 있기 때문에, 세포벽이 얇은 gram negative 미생물은 5초 이내에 고농도 에탄올로 빠르게 탈색 됩니다. 반면에 그람 양성 박테리아에서는 CVI가 그람 음성 박테리아보다 더 강하게 부착되기 때문에 빠른 에탄올 처리는 보라색을 잃지 않습니다. 다음으로 사프라닌을 처리했을 때, 이 물질은 CVI가 없는 세포벽을 붉은 색으로 염색할 수 있습니다. 따라서, CVI가 있는 Gram positive cell에는 사프라닌이 작동할 수 없습니다. 그렇기 때문에 그람 양성 박테리아는 보라색이지만 그람 음성 박테리아는 빨간색입니다. 이러한 원리로 그람 음성균과 그람 양성균을 구별할 수 있습니다.
(학사때 써논 건데 혹시나 필요하신 분들을 위한 정보입니다. 학사때 쓴거라 좀 허접함 주의)
