[생물공학실험] E. Coli Culture, LB Media Preparation And Sterilization

E. Coli Culture, LB Media & Sterilization

E. coli is most commonly used in biotechnology to produce proteins or biological materials. The most commonly used growth medium for E. coli is LB broth (Luria-Bertani broth). To successfully cultivate E. coli, this LB broth contains some growth vectors, vitamins, amino acids, and metabolic energy sources such as glucose. In the growth media, undesired microorganisms can also easily grow. This phenomenon is called “Contamination“. In addition, biotechnological genetically recombined microorganisms have characteristics that grow later than those in nature. Therefore, the sterilization process is very important in biotechnology. To prevent contamination, the medium should be sterilized and removed microorganisms after the appropriate medium has been produced. The most commonly used method is the autoclave method, which sterilizes microorganisms by heating them at 121 degrees for 15 minutes.

 

 

 

E. coli (대장균) 는 생명공학 분야에서 매우 중요합니다. 단백질 또는 생물학적 물질을 생산하기 위해서 대장균이 가장 많이 사용되기 때문입니다. 이 대장균을 키우기 위해서 가장 많이 사용하는 배지는 LB broth 입니다. 대장균을 성공적으로 배양하기 위해서 이 LB broth 안에는 일부 성장 벡터, 비타민, 아미노산, 그리고 포도당과 같은 신진대사의 에너지원을 포함합니다. 이러한 영양분이 가득한 배지에는 우리가 원하지 않는 미생물 또한 쉽게 자랄 수 있습니다. 이런 현상을 contamination이라고 합니다. 덧붙여 생물공학적으로 유전자 재조합된 미생물은 자연계에 있는 생물체보다 더 늦게 자라는 특성이 있습니다. 따라서 이 멸균 과정은 생물 공학에서 매우 중요합니다. Contamination을 방지하기 위해서 배지가 만들어진 후에 배지를 멸균해야 합니다. 가장 많이 사용하는 방법은 Autoclave 방식으로 121도에서 15분간 열을 가해 미생물을 멸균하는 방식입니다.

 

 

Experiment reagents and equipment

Culture (LB) media: Tryptone(10g/ℓ), Yeast extract(5g/ℓ), NaCl(10g/ℓ), Agar(1.5%), distilled water (300 mℓ)

Sterilization: Balance, Autoclave, Magnetic stirrer/bar, Mass cylinder(500㎖), Beaker(500 ㎖ x2), Flask (500 ㎖ x2), Petri dish(8 units), Pipette, Stopper, Spatula, weighting, paper, Aluminum foil

 

 

 

Methods

1.  Put a magnetic bar into a beaker(500㎖), and pour distilled water less than 300㎖ and then stir.
2.  Set a balanced level and adjust to zero before measuring the mass of each reagent.
3.  Fold up a weighting paper diagonally. Wash a spatula with distilled water and wipes.
4.  After reagent measurement for Tryptone 10 g/ℓ, yeast extract 5 g/ℓ, NaCl 10 g/ℓ put them into a beaker and the residue on weighting paper also be added washing with distilled water.
5.  Stir continuously until all reagents completely melt. After that, put them into a mass cylinder and add distilled water up to a total volume, of 300㎖. Confirm the total volume at eye level.
6.  Put Agar 1.5% in a flask and carry the culture media of the mass cylinder into the flask
7.  Plug up a hole in the flask with a stopper and wrap it up with aluminum foil. Sterilize the flask using Autoclave. (121℃, 15 min)
8.  After the sterilization, wait until the temperature and pressure in the autoclave are low, and emit steam. Then take out the flask from the autoclave.  Cool the flask with stirring.
9.  After sufficient cooling off, sterilize the neck of the flask in a flame. Pour 20㎖ of the culture media into a petri dish.
10.  When the culture media become stiff, turn the Petri dishes upside down and seal them with wrap. Store in a fridge.

1. 마그네틱 바를 비커(500ml)에 넣고 300ml 이하의 증류수를 부은 후 저어줍니다.
2. 각 시약의 질량을 측정하기 전에 균형 수준을 설정하고 0으로 조정합니다.
3. 기름 종이를 대각선으로 접습니다. 증류수와 종이로 숟가락을 씻습니다.
4. 트립톤 10g/ℓ, 효모추출물 5g/ℓ, 염화나트륨 10g/ℓ 을 맞춰 측정한 후, 비이커에 넣고 기름 종이의 잔류물도 증류수를 통해 모두 첨가합니다.
5. 모든 시약이 완전히 녹을 때까지 계속 저어줍니다. 그런 다음 매스 실린더에 넣고 증류수를 총 부피 300ml까지 추가합니다.
6. 그 이후, Agar 1.5%를 플라스크에 넣고, 매스 실린더의 배양 배지를 플라스크에 넣습니다.
7. 플라스크의 구멍을 마개로 막고 알루미늄 호일로 싼 후에 Autoclave를 사용하여 멸균합니다. (121°C, 15분)
8. 오토클레이브의 온도와 압력이 낮아질 때까지 기다렸다가 증기를 내보냅니다. 그런 다음 오토클레이브에서 플라스크를 꺼내고 식힙니다.
9. 충분히 식힌 후 플라스크의 목 부분을 화염에 소독하고, 배양액 20ml를 페트리 접시에 붓습니다.
10. 배양 배지가 딱딱해지면 페트리 접시를 뒤집어 랩으로 밀봉합니다. 냉장고에 보관합니다.

 

Result

After cooling down for the media in Petri dishes, the media looks very pure, non-pollute, and no-contaminated. We saved the petri dishes in the refrigerator for the next experiments for one week.

 

I did not take the picture of LB Petri dish, so experiment results after streaking were attached here 🙁

 

 

 

 

Discussion

The exact amounts of tryptone, NaCl, and yeast extract were put into the beaker. 3g of tryptone, 1.5g of NaCl, and 3g of yeast extract were used in a 300 ml cylinder to create a suitable concentration. The materials in distilled water were solved with a magnetic bar and transferred to a flask. We used 4.5g of agar, for 1.5 % concentration. All agar powers were completely dissolved in the flask media, and then the entry of the flask was wrapped in aluminum foil. The flask was sterilized using an autoclave for 121 degrees 15 minutes. Remember that the magnetic bar is pressure-resistant and has high strength, so do not need to remove it from the flask. After cooling the medium, pour 20ml of the medium into each petri dish. When you need to store petri dishes, remember to turn them upside down because of contamination!

 

정확한 양의 트립톤, NaCl, 효모 추출물을 비커에 넣었습니다. 적절한 농도를 만들기 위해 300ml 실린더에 트립톤 3g, NaCl 1.5g, 효모 추출물 3g을 사용했습니다. 마그네틱 막대로 정지된 물에 재료를 녹인 후 플라스크에 부었습니다. 한천 4.5g을 사용하여 한천 1.5%의 액체를 만들었습니다. 모든 한천은 플라스크 액체에 완벽하게 녹았고, 그 이후 플라스크의 입구를 알루미늄 호일로 포장하였습니다. 이 플라스크를 121도 15분 동안 오토클레이브를 사용하여 멸균했습니다. 마그네틱 바는 압력에 강하고 높은 강도를 가지고 있으므로, 제거할 필요가 없다는 점을 기억하세요. 이 배지를 식힌 후에 각 페트리 접시에 20ml의 배지를 부었습니다. 페트리 접시를 보관해야 할 때, 오염 때문에 뒤집혀 있어야 함을 기억하세요.

 

 

 

 

 

 

(학사때 써논 건데 혹시나 필요하신 분들을 위한 정보입니다. 학사때 쓴거라 좀 허접함 주의)